Thursday, February 22, 2024
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डीएनए क्षति के लिए कोशिकाओं को संवेदनशील बनाने वाले उत्परिवर्तन को ठीक करने के लिए एक CRISPR विकल्प

फैंकोनी एनीमिया एक दुर्लभ आनुवंशिक बीमारी है जिसमें आवश्यक डीएनए मरम्मत मार्ग जीन उत्परिवर्तित होते हैं, जिससे डीएनए क्षति प्रतिक्रिया बाधित होती है। फैंकोनी एनीमिया के मरीजों को अस्थि मज्जा की विफलता सहित हेमटोलॉजिकल जटिलताओं का अनुभव होता है, और कैंसर होने की संभावना होती है। फैंकोनी एनीमिया के हेमटोलॉजिकल लक्षणों के लिए एकमात्र उपचारात्मक उपचार एक एलोजेनिक हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल प्रत्यारोपण है, जिसमें एक मरीज को दाता से स्वस्थ स्टेम सेल प्राप्त होता है। हालांकि यह रोग की कुछ जटिलताओं को ठीक कर सकता है या रोक सकता है, स्टेम सेल प्रत्यारोपण अतिरिक्त कठिनाइयों का कारण बन सकता है, जिसमें ग्राफ्ट-बनाम-होस्ट रोग (जीवीएचडी) और कैंसर का बढ़ा हुआ जोखिम शामिल है।1

ऑटोलॉगस ट्रांसप्लांट के लिए रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में फैंकोनी एनीमिया म्यूटेशन को ठीक करने के लिए CRISPR-Cas9 जैसी जीनोम एडिटिंग तकनीकों को लागू करने में रुचि बढ़ रही है, जिसमें सही स्टेम सेल रोगी को वापस दिए जाते हैं। हालांकि, यह बीमारी एक अनूठी चुनौती बन गई है: आप उन कोशिकाओं में जीनोम संपादन तकनीक कैसे लागू करते हैं जो विशेष रूप से डीएनए क्षति के प्रति संवेदनशील हैं? फैंकोनी एनीमिया कोशिकाएं लक्ष्य डीएनए में पारंपरिक CRISPR-Cas9 जीन संपादन द्वारा निर्मित डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को हल नहीं कर सकती हैं, जो शोधकर्ताओं को इस पद्धति के साथ रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तन को प्रभावी ढंग से ठीक करने से रोकता है।

में प्रकाशित एक अध्ययन में आणविक विज्ञान के अंतर्राष्ट्रीय जर्नलब्रैंडन मोरियारिटी और ब्यू वेबर के नेतृत्व में मिनेसोटा विश्वविद्यालय में एक शोध दल ने डबल-स्ट्रैंड डीएनए क्षति को प्रेरित किए बिना फैंकोनी एनीमिया रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में जीन को संपादित करने के लिए बेस एडिटर्स (बीई) नामक कैस9-आधारित टूल का उपयोग किया।2 BEs एक Cas9 एंजाइम से बने फ्यूजन प्रोटीन होते हैं जो लक्ष्य डीएनए (nCas9) और एक डेमिनेज को साफ करते हैं जो साइटिडीन को यूरिडीन (साइटोसिन बेस एडिटर, CBE) या एडेनोसिन को इनोसिन (एडेनोसिन बेस एडिटर, ABE) में परिवर्तित करता है। डीएनए प्रतिकृति या मरम्मत के दौरान, बीई द्वारा लक्षित साइटों को सीबीई के मामले में थाइमिन या एबीई के साथ ग्वानिन के रूप में फिर से लिखा जाता है।

हालांकि आधार संपादक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित नहीं करते हैं, फिर भी वे डीएनए निकालते हैं और डीएनए मरम्मत प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं। इस वजह से, शोधकर्ताओं ने पहले जांच की कि क्या सीबीई और एबीई रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में गैर-फैनकोनी एनीमिया जीन पर काम करेंगे। “वह रहस्य था, आप जानते हैं, क्योंकि [Fanconi anemia patient cells are] डीएनए की मरम्मत में कमी। इसलिए हमें यकीन नहीं था… हमने सोचा कि शायद यह काम करेगा, लेकिन एक सामान्य सेल की तरह नहीं। लेकिन वास्तव में, यह मूल रूप से उसी स्तर पर काम करता है। तो यह बहुत रोमांचक था,” मोरियारिटी ने समझाया।

शोध दल ने तब दिखाया कि सीबीई और एबीई फैंकोनी एनीमिया पैदा करने वाले उत्परिवर्तन को ठीक कर सकते हैं FANCA प्राथमिक रोगी फाइब्रोब्लास्ट और लिम्फोब्लास्टोइड सेल लाइनों में जीन। बेस एडिटिंग ने FANCA प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बहाल किया और डीएनए को नुकसान पहुंचाने वाले रसायन की उपस्थिति में रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के बढ़ने की क्षमता में सुधार किया। इसके अतिरिक्त, संस्कृति में, फाइब्रोब्लास्ट्स को सही किया जाता है FANCA उत्परिवर्तन उन कोशिकाओं से आगे निकल गए जिनमें आधार संपादन विफल रहा। अंत में, शोधकर्ताओं ने मूल्यांकन किया कि क्या बीई विभिन्न फैंकोनी एनीमिया जीन में उत्परिवर्तन को सही कर सकते हैं। एक एल्गोरिथ्म का उपयोग करते हुए, उन्होंने भविष्यवाणी की कि अधिकांश फैंकोनी एनीमिया म्यूटेशन या तो बीई द्वारा या प्राइम एडिटिंग (पीई) नामक एक अन्य एनसीएएस 9-फ्यूजन तकनीक द्वारा सुधारे जा सकते हैं, जो बड़े आनुवंशिक सम्मिलन और विलोपन में सक्षम है।

यह काम द सेंटर फॉर एनर्जी, एनवायरनमेंटल एंड टेक्नोलॉजिकल रिसर्च और ईटीएच ज्यूरिख के एक अन्य शोध समूह के एक प्रीप्रिंट की ऊँची एड़ी के जूते पर आता है, जिन्होंने रोगी रक्त कोशिका लाइनों में एबीई की जांच की। इस समूह ने बीई तकनीक के साथ फैंकोनी एनीमिया जीन को भी प्रभावी ढंग से लक्षित किया, और उनकी जांच एक कदम आगे बढ़ी: उन्होंने रोगी-व्युत्पन्न हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्तन को ठीक किया।3 यह कुछ ऐसा था जो मोरियारिटी और वेबर करने में असमर्थ थे- क्योंकि यह रोग अस्थि मज्जा विफलता सिंड्रोम है, ये कोशिकाएं दुर्लभ हैं। “मूल रूप से, इन रोगियों में स्टेम सेल नहीं होते हैं,” पेरिस सिटी यूनिवर्सिटी के इंस्टीट्यूट इमेजिन के एक वरिष्ठ शोधकर्ता और प्रयोगशाला निदेशक, अन्नारिता माइकियो बताते हैं, जो किसी भी अध्ययन में शामिल नहीं थे। “ये बहुत चुनौतीपूर्ण प्रयोग हैं, और प्रयोगों से अधिक, की चुनौती” [treating] फैंकोनी एनीमिया ठीक यही है – कोशिकाओं की संख्या।”

इस चुनौती के बावजूद, शोधकर्ताओं ने डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक की आवश्यकता के बिना, फैंकोनी एनीमिया में उपचार के दृष्टिकोण के रूप में जीनोम संपादन के लिए आधार तैयार किया है। “मुझे लगता है कि हमने जो अध्ययन किया वह अवधारणा का एक अच्छा, ठोस सबूत है, और अगले चरणों के लिए मंच तैयार करता है, लेकिन निश्चित रूप से, यह कहानी का अंत नहीं है,” वेबर ने कहा।

[References]

  1. बीपी ऑल्टर, “विरासत में मिली अस्थि मज्जा विफलता सिंड्रोम: विचार पूर्व और पोस्टट्रांसप्लांट,” खून130:2257-64, 2017।
  2. सी। सिप एट अल।, “डिजिटल जीनोम इंजीनियरिंग का उपयोग करके फैंकोनी एनीमिया म्यूटेशन का सुधार,” इंट जे मोल साइंस23:1-20, 2022।
  3. एसएम सिग्नेर एट अल।, “एडेनिन बेस एडिटिंग डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए ब्रेक के बिना एफए रोगी कोशिकाओं में कार्य को बहाल करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण है,” 489197, बायोरेक्सिव, 2022 पर प्रीप्रिंट।

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